产品简介
单细胞测序技术（ single cell sequencing）是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术，它能够弥补传统高通量测序的局限性，揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性。2013 年，单细胞测序技术被《 Science》将其列为年度最值得关注的六大领域榜首；2015 年再次登上 Science转化医学封面。目前，单细胞测序技术在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学、以及植物学等领域发挥重要作用，正成为生命科学研究的焦点，具有广阔的应用前景。
单细胞转录组测序流程 --点我了解更多
我们的优势
1. 拥有行业认可的 10X Genomics和BD Rhapsody单细胞平台，实现真正意义上的单细胞测序；
2. 具有丰富的、针对不同样本类型的单细胞悬液制备经验，如：外周血、细胞系、新鲜 /冻存器官组织、肿瘤组织，确保细胞活性达到测序要求；
3. 拥有成熟的单细胞测序文库构建技术，一次性完成 1000-10000个细胞的文库构建，真正测全组织中所有细胞类型，做到对样本中所有类型细胞的全面解析；
4. 具备完善的单细胞测序和实验质控流程，以及丰富的单细胞测序和数据分析经验，实现个性化、定制化数据分析服务。
样本要求
样本类型：
组织、血液、培养的细胞系、制备好的单细胞悬液
注：若客户样本为组织，且无能力进行组织解离来获取单细胞悬液，火狐体育app官网将尽可能提供技术及实验上的帮助，但因不同类型样本的特异性，无法保证实验方法适用于所有类型组织。
质量要求：
1. 细胞活性大于 70%
2. 浓度为 500-2000细胞/μl
3. 体积不小于 200μl
4. 细胞培养基及缓冲液不能含 Ca 2+ 和Mg 2+
5. 细胞体积小于 40μm
实验流程
1. 单细胞悬液制备：根据样本特性选择合适的单细胞悬液制备方法，注意红细胞裂解；如若客户样本为已经制备好单细胞悬液，该步骤可以省略；
2. 细胞活性检测： 细胞活性需大于 70%；
3. 单细胞捕获：通过分选平台（ BD、10X、Drop-seq）对每个细胞进行捕获；
4. 细胞 /转录本标签添加：对结合磁珠标签的RNA进行逆转录引入CB和UMI；
5. 文库构建：对 cDNA进行随机引物PCR扩增；
6. 上机测序：火狐体育app官网推荐 Illumina Hiseq或NovaSeq测序平台 ，数据量 100G/样本。
数据分析流程
结果示例
单细胞悬液的制备流程
BD Rhapsody Scanner检测图
注：活细胞检测明场图（左），绿色荧光（中），红色荧光（右）
图一：Drop-Seq
哈佛医学院 Steven McCarroll领导的团队 将微流控技术引入单细胞 RNA-seq方法中，开发了Drop-seq 技术，且该项技术于 2015 年发表于《 Cell》杂志上（ Macosko et al., 2015 ）。Drop-seq技术利用微流体装置将带有细胞条形码的微珠和细胞一起装入微滴。这些液滴在一个小型设备上生成，沿着一根头发宽的槽道流动。条形码附着到每个细胞的一些基因上，因此科学家们可以一次测序所有的基因，追踪每个基因的来源细胞。
图二：10X Genomics
2016 年， 10X Genomics 公司首次推出 Chromium TM 系统 ，全面对接 Illumina测序仪，能够自动化完成大规模单细胞研究。10X Genomics单细胞捕获平台起源自Drop-Seq技术，通过“双十字”微流控系统形成一个个含有细胞和凝胶微珠（gel bead ）的油包水的乳滴（ GEMs），其核心技术在于凝胶微珠表面的引物序列，由标记细胞的Barcode、标记细胞内mRNA 的 UMI和捕获mRNA 的 Poly dT组成。10X Genomics Chromium TM 系统可实现数千乃至数万个单细胞的分析，解决常规 scRNA-seq在通量或扩展性方面存在的不足。
图三：BD Rhapsody
BD Rhapsody™单细胞分析系统的诞生基于 BD 在细胞生物学领域 40年的专业技术， 采用 CytoSeq特有的蜂窝板技术进行单细胞捕获。该技术用20W+的微孔（该数量级远大于Input细胞数量），保证单孔中的单细胞捕获。同时避免了传统微流控系统中存在的概率碰撞影响捕获效率的问题，采用微孔捕获相对会有更好的捕获效率，保证Input细胞的全面使用。
NovaSeq 6000测序仪
注：横坐标为细胞数量，纵坐标为每个细胞对应的平均 counts数，根据曲线的斜率判断实际检测的细胞数量
注：左图为细胞中总共检测到的基因数量，右图为去除重复 UMI后统计的基因数量
注：横坐标表示每个细胞中 UMI的数量，纵坐标表示线粒体基因的占比情况
Azizi E et al., Cell. 2018
注：上图为乳腺癌肿瘤组织、正常组织、血液和淋巴结样本中免疫细胞亚群鉴定；下图为不同组织样本中各细胞亚群的占比情况
Dick S A et al., Nature immunology. 2019
注： marker基因的Feature Plot 图（上）和 Violin图（下）
Dick S A et al., Nature immunology. 2019
注：该图为不同细胞亚群间差异基因聚类分析图（ Heatmap）
Dick S A et al., Nature immunology. 2019
注：该图为不同 cluster之间差异基因显著富集的Pathway条目
Manno G L et al., Nature, 2018
注：该图为 RNA velocity分析结果图，图中箭头方向代表算法预测的细胞演化方向
Dick S A et al., Nature immunology. 2019
注：细胞间状态转换的 pesudotime 轨迹图（右）和 Heatmap图（左）
Vento-Tormo R et al., Nature. 2018
注：横坐标表示细胞类型，纵坐标表示细胞间通讯关系，圆圈大小表示显著性差异水平，圆圈颜色越红表示细胞间通讯关系越强
Guo X, et al. Nature Medicine, 2018
注：横坐标表示生存期，纵坐标表示占比，不同颜色曲线代表不同分组
文献示例
[1] Mickelsen LE, Bolisetty M, Chimileski BR, et al. Single-cell transcriptomic analysis of the lateral hypothalamic area reveals molecularly distinct populations of inhibitory and excitatory neurons[J]. Nat Neurosci. 2019 Apr;22(4):642-656.(IF=19.912)
[2] Pijuan-Sala B, Griffiths JA, Guibentif C, et al. A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis[J]. Nature. 2019 Feb;566(7745):490-495.(IF=41.577)
[3] Cao J, Spielmann M, Qiu X, et al. The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis[J]. Nature. 2019 Feb;566(7745):496-502.(IF=41.577)
[4] Tiklová K, Björklund ÅK, Lahti L, et al. Single-cell RNA sequencing reveals midbrain dopamine neuron diversity emerging during mouse brain development[J]. Nat Commun. 2019 Feb 4;10(1):581.(IF=12.353)
[5] Bartoschek M, Oskolkov N, Bocci M, et al. Spatially and functionally distinct subclasses of breast cancer-associated fibroblasts revealed by single cell RNA sequencing[J]. Nat Commun. 2018 Dec 4;9(1):5150.(IF=12.353)
[6] Guo X, Zhang Y, Zheng L, et al. Global characterization of T cells in non-small-cell lung cancer by single-cell sequencing[J]. Nature Medicine. 2018 Jul;24(7):978-985.(IF=32.621)
[7] Azizi E, Carr AJ, Plitas G, et al. Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment[J]. Cell. 2018 Aug 23;174(5):1293-1308.e36.(IF=31.398)
[8] Fujii M, Matano M, Toshimitsu K,et al. Human Intestinal Organoids Maintain Self-Renewal Capacity and Cellular Diversity in Niche-Inspired Culture Condition[J]. Cell Stem Cell. 2018 Dec 6;23(6):787-793.e6.(IF=23.29)
[9] Dick SA, Macklin JA, Nejat S, et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction[J]. Nat Immunol. 2019 Jan;20(1):29-39.(IF=21.809)
[10] Kumar M P, Du J, Lagoudas G, et al. Analysis of Single-Cell RNA-Seq Identifies Cell-Cell Communication Associated with Tumor Characteristics[J]. Cell Reports. 2018 Nov 6;25(6):1458-1468.e4.(IF=8.032)