单细胞测序技术( single cell sequencing)是指在单个细胞水平上,对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术,它能够弥补传统高通量测序的局限性,揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态,反映细胞间的异质性。2013 年,单细胞测序技术被《 Science》将其列为年度最值得关注的六大领域榜首;2015 年再次登上 Science转化医学封面。目前,单细胞测序技术在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学、以及植物学等领域发挥重要作用,正成为生命科学研究的焦点,具有广阔的应用前景。
单细胞转录组测序流程 --点我了解更多
1. 拥有行业认可的 10X Genomics和BD Rhapsody单细胞平台,实现真正意义上的单细胞测序;
2. 具有丰富的、针对不同样本类型的单细胞悬液制备经验,如:外周血、细胞系、新鲜 /冻存器官组织、肿瘤组织,确保细胞活性达到测序要求;
3. 拥有成熟的单细胞测序文库构建技术,一次性完成 1000-10000个细胞的文库构建,真正测全组织中所有细胞类型,做到对样本中所有类型细胞的全面解析;
4. 具备完善的单细胞测序和实验质控流程,以及丰富的单细胞测序和数据分析经验,实现个性化、定制化数据分析服务。
样本类型:
组织、血液、培养的细胞系、制备好的单细胞悬液
注:若客户样本为组织,且无能力进行组织解离来获取单细胞悬液,火狐体育app官网将尽可能提供技术及实验上的帮助,但因不同类型样本的特异性,无法保证实验方法适用于所有类型组织。
质量要求:
1. 细胞活性大于 70%
2. 浓度为 500-2000细胞/μl
3. 体积不小于 200μl
4. 细胞培养基及缓冲液不能含 Ca 2+ 和Mg 2+
5. 细胞体积小于 40μm
1. 单细胞悬液制备:根据样本特性选择合适的单细胞悬液制备方法,注意红细胞裂解;如若客户样本为已经制备好单细胞悬液,该步骤可以省略;
2. 细胞活性检测: 细胞活性需大于 70%;
3. 单细胞捕获:通过分选平台( BD、10X、Drop-seq)对每个细胞进行捕获;
4. 细胞 /转录本标签添加:对结合磁珠标签的RNA进行逆转录引入CB和UMI;
5. 文库构建:对 cDNA进行随机引物PCR扩增;
6. 上机测序:火狐体育app官网推荐 Illumina Hiseq或NovaSeq测序平台 ,数据量 100G/样本。
单细胞悬液的制备流程
BD Rhapsody Scanner检测图
注:活细胞检测明场图(左),绿色荧光(中),红色荧光(右)
图一:Drop-Seq
哈佛医学院 Steven McCarroll领导的团队 将微流控技术引入单细胞 RNA-seq方法中,开发了Drop-seq 技术,且该项技术于 2015 年发表于《 Cell》杂志上( Macosko et al., 2015 )。Drop-seq技术利用微流体装置将带有细胞条形码的微珠和细胞一起装入微滴。这些液滴在一个小型设备上生成,沿着一根头发宽的槽道流动。条形码附着到每个细胞的一些基因上,因此科学家们可以一次测序所有的基因,追踪每个基因的来源细胞。
图二:10X Genomics
2016 年, 10X Genomics 公司首次推出 Chromium TM 系统 ,全面对接 Illumina测序仪,能够自动化完成大规模单细胞研究。10X Genomics单细胞捕获平台起源自Drop-Seq技术,通过“双十字”微流控系统形成一个个含有细胞和凝胶微珠(gel bead )的油包水的乳滴( GEMs),其核心技术在于凝胶微珠表面的引物序列,由标记细胞的Barcode、标记细胞内mRNA 的 UMI和捕获mRNA 的 Poly dT组成。10X Genomics Chromium TM 系统可实现数千乃至数万个单细胞的分析,解决常规 scRNA-seq在通量或扩展性方面存在的不足。
图三:BD Rhapsody
BD Rhapsody™单细胞分析系统的诞生基于 BD 在细胞生物学领域 40年的专业技术, 采用 CytoSeq特有的蜂窝板技术进行单细胞捕获。该技术用20W+的微孔(该数量级远大于Input细胞数量),保证单孔中的单细胞捕获。同时避免了传统微流控系统中存在的概率碰撞影响捕获效率的问题,采用微孔捕获相对会有更好的捕获效率,保证Input细胞的全面使用。
NovaSeq 6000测序仪
注:横坐标为细胞数量,纵坐标为每个细胞对应的平均 counts数,根据曲线的斜率判断实际检测的细胞数量
注:左图为细胞中总共检测到的基因数量,右图为去除重复 UMI后统计的基因数量
注:横坐标表示每个细胞中 UMI的数量,纵坐标表示线粒体基因的占比情况
Azizi E et al., Cell. 2018
注:上图为乳腺癌肿瘤组织、正常组织、血液和淋巴结样本中免疫细胞亚群鉴定;下图为不同组织样本中各细胞亚群的占比情况
Dick S A et al., Nature immunology. 2019
注: marker基因的Feature Plot 图(上)和 Violin图(下)
Dick S A et al., Nature immunology. 2019
注:该图为不同细胞亚群间差异基因聚类分析图( Heatmap)
Dick S A et al., Nature immunology. 2019
注:该图为不同 cluster之间差异基因显著富集的Pathway条目
Manno G L et al., Nature, 2018
注:该图为 RNA velocity分析结果图,图中箭头方向代表算法预测的细胞演化方向
Dick S A et al., Nature immunology. 2019
注:细胞间状态转换的 pesudotime 轨迹图(右)和 Heatmap图(左)
Vento-Tormo R et al., Nature. 2018
注:横坐标表示细胞类型,纵坐标表示细胞间通讯关系,圆圈大小表示显著性差异水平,圆圈颜色越红表示细胞间通讯关系越强
Guo X, et al. Nature Medicine, 2018
注:横坐标表示生存期,纵坐标表示占比,不同颜色曲线代表不同分组
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