半月板在关节稳定、减震、接触力分布和关节润滑等方面起着重要作用，其包含不同的细胞类型，主要包括软骨细胞形态细胞和纤维细胞形态细胞。然而， 半月板的细胞类型组成、分布和相应的生物标志物，以及治疗半月板退变的生物靶点仍不清楚 。
2019年12月7日，中山大学附属第一医院廖威明教授课题组和张志奇教授课题组通过ScRNA-Seq详细描绘半月板的细胞组成， 鉴定出一种在半月板组织工程中具有应用前景的祖细胞，并证明了半月板的退变机制。并且通过 TGFβ1 治疗有效缓解半月板退变提出一种半月板退变的潜在治疗策略 。此次研究工作中的单细胞RNA测序实验与数据分析由 火狐体育app官网科技 参与支持。该研究成果以“Single- cell RNA- seq analysis identifies meniscus progenitors and reveals the progression of meniscus degeneration”为题发表于《 Annals of the Rheumatic Diseases》（IF=14.299）期刊。
分析思路：
测序样本信息：
健康半月板样本、退变半月板样本
测序平台：
BD Rhapsody系统
测序数据量：
100G
研究结果：
1. ScRNA-Seq 揭示健康人半月板的细胞组成类型
研究者首先对健康人的半月板组织进行ScRNA-Seq，对3639个细胞进行t-SNE分析，共 分出 7 个亚群，其中包含两个新发现的细胞亚群 ：
① 内皮细胞(EC)；②软骨细胞祖细胞 (CPC)；③调节性软骨细胞(RegC)；④纤维软骨细胞（FC)；⑤预肥大软骨细胞(PreHTC)； ⑥纤维软骨细胞祖细胞(FCP)；⑦增殖纤维软骨细胞(ProFC)。 并进一步通过免疫组化来确定各细胞亚群的分布 ，FCP主要分布于半月板表面，RegC在半月板中部，EC存在于红区血管周围 ，而PreHTC分布于白区。
图1 健康人半月板的单细胞图谱
2. 健康人半月板细胞的分化轨迹分析
研究者通过拟时序分析发现FCP和EC存在于分化轨迹的起始处。为了进一步探究FCP是否具有祖细胞的性质，根据高表达基因分选出CD146+原代半月板细胞，并对其进行分化和克隆能力的验证。通过集落形成和多向分化潜能分析实验验证CD146+细胞可以向成骨细胞和脂肪细胞分化并形成集落。 提示在健康人半月板细胞中， FCP 具有祖细胞的特性。
图2 人半月板祖细胞的鉴定
为了研究FCP的分化轨迹，研究者选取了FCP、ProFC、FC、PreHTC和RegC重新构建了一条新的分化轨迹（图3A）。轨迹起始部位由FCP和ProFC组成，其后为PreHTC，而末端Fate 1为FC，末端Fate 2由RegC组成（图3B）。进一步分析FCP向 Fate1和Fate2分化过程中各亚群细胞基因表达模式（图3C、3D）。
为了确定细胞分化轨迹，研究者分析了各亚群细胞的差异表达基因及表达模式，并研究了体内半月板发育过程，观察1、2、3、4、8、26和52周小鼠半月板中marker基因的表达情况（图3E）：COL1A1出生后表达逐渐增强，在4周时达到高峰，随后表达量逐渐降低；MYLK在3周后，表达量显著下降。体内实验的基因表达趋势与测序分析得出的趋势相一致， 进一步验证了 FCP 的分化轨迹。
图3 FCP分化的单细胞轨迹分支点分析
3. 健康人群半月板与退变半月板单细胞图谱的 对比分析
研究者首先通过观察组织结构变化，发现退变半月板的胶原纤维结构紊乱（图4A）。然后对健康和退变半月板进行ScRNA-Seq分析（图4B-E），发现 退变半月板的各细胞亚群占比发生显著变化，并发现三个新的亚群 ：(1)单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)；(2)肥大软骨细胞(HTC)；(3)退变半月板祖细胞(DegP)。
图4 健康人半月板与退变半月板单细胞图谱的对比分析
4. 单细胞分化轨迹提示 DegP 是半月板退变的关键因素
研究者通过集落形成和多向分化潜能分析实验发现DegP（CD318+细胞）可以形成集落并向多种细胞分化，证明在退变半月板中，DegP具有祖细胞特性。因此，研究者重新选取FCP、ProFC、CPC和DegP四个亚群来构建分化轨迹，轨迹起始端主要由FCP和ProFC组成，Fate 1和Fate 2分别由DegP和CPC组成（图5A、5B）。
通过比对健康与退变半月板的命运分支点基因表达情况，发现在半月板的退变过程中，FCP向DegP的分化是异常的细胞状态（图5C、5D）。研究者对此采用免疫组化染色实验证实DegP标记基因（GAS1、DNER）在半月板病变且细胞增殖的区域显著高表达(图5E)。
此外，研究者还利用IL-1β分别刺激健康和退变半月板细胞，得到相似的结果：CD146+细胞减少和CD318+细胞增加， 提示促炎介质 IL-1β 诱导 DegP 活化是半月板退变的机制。
图5 单细胞分化轨迹提示DegP是半月板退变的关键因素
5. TGFβ 信号通路的激活可以抑制退变半月板 CD318+ 细胞的增加
由于TGFβ信号通路激活后会增强半月板干细胞的分化能力。研究者观察到在健康半月板细胞中TGFβ信号通路被上调，而且其配体TGFβ1显著高表达（图6A-D）。因此，研究者利用TGFβ1体外刺激退变半月板细胞，发现CD318+细胞数量明显减少、COL1A1（FCP标记基因）表达量增加（图6E、6F），提示 TGFβ 可能有延缓半月板退 变的作用 。
图6 TGFβ信号通路的激活可以抑制退变半月板Cd318+细胞的增加
综上所述，研究者通过使用ScRNA-Seq全面描绘了健康及退变半月板细胞的图谱，并确定了在半月板组织工程中具有重要意义的CD146+祖细胞。其次，研究者还证实了促炎介质诱导DegP活化是半月板退变的可能机制，TGFβ可以减少DegP的比例，这可能成为延缓半月板退变的治疗策略。
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