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单细胞转录组联合TCR||阿尔茨海默氏病人脑脊液中存在克隆扩增的CD8+T细胞 时间:2020-02-27

神经炎症在阿尔茨海默氏病 Alzheimer’s disease 简称 AD 中起到至关重要的作用,但目前对于适应性免疫反应与 AD 之间的 关系 知之甚少。大脑的淋巴系统将来自脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)的免疫细胞运送至颈深淋巴结中,从而使外周T细胞能够对脑部抗原作出应答反应。但是, AD 患者的持续 神经炎症是否与T细胞进入脑中有关目前尚不可知。

T细胞受体( T cell receptor , TCR)与抗原的相互作用对于适应性免疫至关重要。当T细胞识别同源抗原(cognate antigen)时会发生克隆扩增。而且TCR序列具有多样性,对于单个T细胞具有特异的TCR序列。因此,发现两个或两个以上具有相同TCR序列的T细胞便可认为是T细胞发生克隆扩增的证据。目前已有研究发现AD患者外周的T细胞分布、功能以及细胞因子分泌的变化,但导致这些变化的抗原目前仍不清楚。


2020 1 月8日,美国斯坦福大学的 Mark M Davis Tony Wyss-Coray 团队 发现 AD 患者的脑脊液中存在克隆扩增的T细胞,同时 还发现其中一类 T 细胞与认知能力具有相关性,通过单细胞 TCR 的分析发现克隆扩增的T细胞能够识别 EB 病毒的两种不同抗原。该研 究成果以 Clonally expanded CD8 T cells patrol the cerebrospinal fluid in Alzheimer’s disease 为题发表 Nature 杂志上。

分析思路:


检测样本信息:

PBMC,脑组织,脑脊液

检测平台:

质谱流式细胞技术,免疫组织化学,Plate-seq,Drop-seq(10X Genomics)

研究结果:

1.  AD 患者外周血 CD8 +  T EMRA 细胞增多且与认知能力呈负相关

研究者通过多个队列分析来评估AD的适应性免疫(图1a),使用 质谱流式细胞技术研究了AD患者和前驱轻度认知障碍(MCI)患者的外周血单个核细胞(PBMC)。然后使用聚类计算方法(spanning-tree progression analysis of density-normalized events,SPADE)进行聚类分析,发现患有MCI或AD的患者存在细胞数显著增多的CD8 + 群体(图1b),即cluster 63。该细胞群体的标志物与CD3 + CD8 + CD27 -  T效应记忆CD45RA + (T EMRA )细胞标志物相一致(图1d),是一种能够分泌促炎性细胞因子和细胞毒性分子的具有效应性功能的细胞群体。

为了进一步研究CD8 +  T细胞在MCI和AD中的作用,研究者在Cohort 2 (图1a)中评估了认知与记忆T细胞种群之间的关系。揭示了在MCI和AD中, CD8 +  TEMRA细胞与认知能力呈负相关(图1e)。使用PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)刺激PBMC后,来自MCI或AD患者的CD8 +  T细胞的IFN-γ水平明显高于对照CD8 +  T细胞(图1f),即MCI或AD患者的外周CD8 +  T细胞相较于正常人存在一定的功能差异。然后对CD8 +  TEMRA细胞进行drop-seq单细胞测序且通过差异表达和通路分析发现,MCI和AD患者中CD8 + TEMRA细胞的氨基酸代谢显着减少,TCR和细胞因子信号传导增加(图1g,h)。

以上结果表明,与对照组相比, MCI AD 患者的外周 CD8 +  TEMRA 细胞具有更大的抗原刺激性。


图1 MCI/AD患者中发现的TEMRA细胞受到抗原刺激性更大

2.  CD8 +  T 细胞进入 AD 患者的大脑

接下来研究者为了确定 AD患者的大脑中是否存在CD8 +  T细胞,对Cohort 3(图1a)中正常人和AD患者的大脑进行CD8和Aβ 免疫组化实验 ,以及CD8 +  T细胞与大脑血管接近程度的分析。发现在三个AD大脑海马区,伴有脑淀粉样血管病变的血管周隙中存在大量血管外CD8 +  T细胞(图2a),受 AD影响的海马中CD3 + CD8 +  T细胞明显多于对照海马(图2b),且CD8 +  T细胞与微管相关蛋白2 (MAP2) + 神经元具有一定的相关性(图2c)。最后研究者从AD患者的大脑海马附近的软脑膜中也检测到了CD3 + CD8 +  T细胞(图2d)。

以上研究结果表明,在 AD 患者的大脑中检测到了 CD8 +  T 细胞的存 在。


图2 AD患者大脑中检测到CD8 +  T细胞


3.  AD 患者脑脊液中 CD8 +  TEMRA 细胞的克隆扩增

CD8 +  T细胞在脑软脑膜的定位促使研究者想要继续探索抗原特异性细胞是否也在CSF中存在。研究者发现健康老年受试者的CSF中的免疫细胞主要包含T细胞,以及少量的先天免疫细胞和微量的B细胞,其中CD8 +  T细胞群几乎完全由效应记忆性T细胞(T effector memory,T EM )细胞组成,TEMRA细胞约占该T EM 群的20%。

在接下来的研究中,研究者使用 plate-seq和drop-seq两种测序方法进行 T细胞的克隆扩增评估,患者数据均来源于 Cohort 4(图1a)。发现在CSF的T细胞中主要是CD8 + T细胞发生克隆扩增,其中一位AD患者的存在大量扩增的克隆, 占CD8 +  T细胞的44%(图3b)。随后Marker基因鉴定发现该克隆为 CD8 +  CD45RA  +  CD27 -  TEMRA细胞(图3c)。 这项发现首次提出了 受年龄相关神经退行性病变影响的大脑脑脊液中存在克隆扩增的 CD8 +  T 细胞。

研究者使用drop-seq对CSF细胞进行细胞分群时同样发现大多数CSF细胞是T细胞(图3d,e)。然后对这些细胞进行了单细胞TCR测序(scTCR-seq),发现来自MCI或AD患者的CSF细胞中有许多高度扩增的CD8 + 克隆,而对照组则相反(图3f,g,h)。通过差异表达分析发现MCI和AD中高度扩增的克隆(即具有五个以上相同TCRαβ序列的T细胞)表现出细胞毒性效应基因的表达增加(图3i)。通过 占比分析发现49.13%的克隆扩增细胞是CD8 +  TEMRA细胞(图3j),且MCI和AD中的这类细胞同样表现为细胞毒性效应基因表达的增加。尤其在MCI和AD病患中高表达影响认知的衰老因子人类白细胞抗原C(HLA-C)和β-2-微球蛋白(B2M)以及其他与AD相关的基因。(图3k)。研究者还发现CD8 +  T细胞中GZMA基因的表达(图3l)以及AD患者海马中GZMA + CD8 + 细胞具有更高的百分比(图3m)。

以上结果揭示了 AD 患者的 CSF CD8 +  TEMRA 克隆细胞的促炎和细胞毒性功能。

3   AD 患者的 CSF CD8 +  TEMRA 细胞发生克隆扩增且具有促炎功能

4.AD 患者脑脊液中克隆扩增 TCRs 的抗原鉴定

接下来,研究者希望确定是何种抗原引起了 CD8 TEMRA 细胞的克隆扩增。 通过构建 TCRαβ 序列的 未加权网络发现一例MCI和一例AD患者间具有一个共享的克隆,而另一例AD患者共享了其中的 TCRβ 序列,这条 TCRβ 序列 CASSLGQAYEQYF 一种疱疹病毒EBV的 EBNA3A 抗原( Herpesviridae Epstein–Barr nuclear antigen 3 具有特异性(图 4b ),并在 克隆中发现细胞毒性效应基因表达增加(图 4c )。随后研究者使用 GLIPH 算法对 未知的 TCR 序列进行 特异性抗原 的确定。发现 AD 患者共享的 TCRβ CASSLAGGYNEQFF )与 第三位AD患者的 TCRβ 链( CASSLGTGNNEQFF 具有同源性(图 4d )。

通过构建表达 TCRαβ1 TCRαβ2 细胞系,发现 TCRαβ1 细胞对 MHC-1 肽库有反应,而 TCRαβ2 细胞无反应(图 4e )。然后将 TCRαβ2 作为对照,发现只有一个肽段激活了 TCRαβ1 细胞,即来源于EB病毒反式激活蛋白 BZLF1 7-RAKFKQL L (图 4f,g )。

以上,研究者通过对TCR的测序及分析发现了AD中一种新型的TCR,对EBV反式激活蛋白BZLF1具有特异性。

4   AD 患者 CSF 细胞中 TCR 的抗原鉴定

综上所述,研究者通过对 TCR 序列的分析证明了 AD CD8 +  T 细胞的抗原特异性克隆的扩增,并鉴定出 EBV 抗原的特异性 TCR ,虽然还不足以说明 EBV 感染与 AD 之间有明确的因果关系,但通过分析 TCR ,鉴定克隆以及通过 TCR 识别抗原的方法将会为研究神经退行性疾病的适应性免疫提供新的途径。


原文链接: http://nature.webvpn.ustc.edu.cn/articles/s41586-019-1895-7


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