单细胞测序技术(single cell sequencing)是指在单个细胞水平上,对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术,它能够弥补传统高通量测序的局限性,揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态,反映细胞间的异质性。2013年,单细胞测序技术被《Science》将其列为年度最值得关注的六大领域榜首;2015年再次登上Science转化医学封面。目前,单细胞测序技术在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学、以及植物学等领域发挥重要作用。 正成为生命科学研究的焦点。具有广阔的应用前景。
火狐体育app官网单细胞测序为了准确快速地进行单细胞测序研究,基于前沿的研究文献进行多重优化,真正做到准确可靠全面的单细胞测序解析
组织、血液、培养的细胞系、制备好的单细胞悬液
注:若客户样本为组织,且尚未成功将组织样本消化成单细胞悬液,火狐体育app官网将尽可能提供技术及实验上的帮助,但因不同类型样本的特异性,无法保证实验方法适用于所有类型组织。
细胞活性大于70%,浓度为500-2000细胞/μl,
体积不小于200μl,细胞培养基及缓冲液不能含Ca2+和Mg2+,细胞体积小于40μm。
采用Fastp软件对下机原始数据进行质控,对质控后测序数据中的cell barcode信息及其对应的counts数进行统计,判断测序样本中实际检测到的细胞数量,获得样本的测序细胞数,并根据最终确认的cell barcode信息提取对应的reads。
注:横坐 标为细胞数量,纵坐标为每个细胞对应的平均 counts 数,根据曲线的斜率判断实际检测的细胞数量
以cell barcode对应的reads为研究对象,采用STAR算法将测序数据比对到物种对应的基因组上,获得基因组比对的bam文件。再以bam文件以及基因组注释文件为研究对象,将比对到同一基因上的UMI进行合并,并去除其中重复的UMI序列,得到每个基因的UMI数量,统计每个细胞中检测到的基因数以及转录本数量,并得到表达量矩阵表。
注:左图为细胞中总共检测到的基因数量,右图为去除重复 UMI 后统计
利用基因组比对结果以及表达量结果对测序检测到的细胞进行过滤,去除细胞中基因检测数少、线粒体基因占比大的细胞,统计过滤后的细胞数量并得到对应的表达量矩阵表。采用数据标准化方法(CPM/RLE/UQ/TMM/scran/Downsampling等),对不同样本中细胞基因表达量进行标准化,得到标准化后的表达量矩阵表。
注:横坐标表示每个细胞中UMI的数量,纵坐标表示线粒体基因的占比情况
基于每个细胞中的基因表达量数据,采用聚类算法对细胞进行亚群分析,同时采用 t-SNE 分析对细胞的分群结果进行可视化展示。同时,还可以对不同样本中各细胞亚群的占比情况进行统计分析。
注:上图为乳腺癌肿瘤组织、正常组织、血液和淋巴结样本中免疫细胞亚群鉴定;下图为不同组织样本中各细胞亚群的占比情况
鉴定不同细胞亚群中的Marker基因,并对Marker基因的表达分布进行可视化展示。
注: marker基因的Feature Plot图(上)和Violin图(下)
针对所有或者特定细胞亚群,进行细胞亚群间差异表达基因筛选,获得细胞亚群间差异表达基因。
注:该图为不同细胞亚群间差异基因聚类分析图(Heatmap)
分别采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO数据库,以及KEGG数据库,对Marker基因/差异基因进行功能分析和信号通路分析,从而得到这些基因群体所显著性富集的GO条目和Pathway条目。
注:该图为不同cluster之间差异基因显著富集的Pathway条目
采用velocyto算法,预测单个细胞的变化方向,得到细胞间的转变过程。
注:该图为RNA velocity分析结果图,图中箭头方向代表算法预测的细胞演化方向
以细胞的表达量数据为研究对象,采用TSCAN/monocle/SLICER/Ouija等算法,在虚拟时间轴上对细胞的变化模式进行分析,模拟重建细胞的动态变化过程,获得细胞间的状态转换关系,以及不同状态细胞间差异基因的表达情况。
注:细胞间状态转换的pesudotime轨迹图(上)和Heatmap图(下)
以细胞亚群的基因表达量数据为研究对象,获得细胞中的配体及受体基因的表达信息,得到细胞亚群间的信号通讯关系。
注:横坐标表示细胞类型,纵坐标表示细胞间通讯关系,圆圈大小表示显著性差异水平,圆圈颜色越红表示细胞间通讯关系越强
以TCGA临床信息以及筛选到的关键基因为研究对象,结合TCGA临床数据,进行预后分析,获得该基因/基因集与临床预后之间的关系。
注:横坐标表示生存期,纵坐标表示占比,不同颜色曲线代表不同分组